卵丘细胞对羊体外受精效果的影响试验分析

为了探索卵丘细胞对体外成熟卵母细胞体外受精效果的影响，试验采用体外成熟后卵母细胞脱除卵丘细胞组、部分脱除组及不脱除组。下面一起来看看：卵丘细胞对羊体外受精效果的影响试验分析。

卵丘细胞对成熟卵母细胞体外受精作用包括：吸引、阻绊和筛选精子；精子的获能，顶体反应和穿人；防止卵母细胞的提前硬化。本研究旨在探索卵丘细胞对成熟卵母细胞的体外受精效果的影响。

1、材料

1.1　实验样品

实验用羊卵巢采集于牛羊屠宰场，屠宰羊为德国肉用美利努与小尾寒羊杂交的品种。

1.2　主要仪器设备

倒置显微镜：MSS100，美国；超净操作台：Extra　-　lowFan　Filter　Unit，Envirco，CA，USA;　C02培养箱：(美国，Thermo)；离心机：CN　820，MRC　Ltcl，Israel；恒温板：KH-P431;水浴锅：天津市华仪鑫达仪器，HH-4。1.3　主要试剂与配制

所用试剂除特殊说明外，都购自Sigma公司。胎牛血清(　FCS)和BO液购自Gibco，促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)和雌二醇(E2)购自宁波激素厂，试验使用的培养皿购自丹麦Nunc公司。

发情羊血清(　ESS)为自制；抽卵液：TCM　-　199+10　IU/mL肝素+2%　FCS;成熟液：TCM-199+10%　FCS+10　Ug／mL　FSH　+1　rig/mL　LH　+1肛g／mL　E2;洗精液：SOF液+lOtig／ml,肝素+10%　ESS;受精液：SOF液+3　mg/mLBSA+10　rig／ml,肝素+20%ESS+　10-9　mol／L褪黑素。

1.4试验设计

体外受精实验设计为3组：不脱除卵丘细胞组、部分脱除组、脱除组。实验1各组分别与卵丘细胞共培养；实验2各组分别与褪黑素共培养；实验3各组分别与填加卵丘细胞和褪黑素共同作用。

2、方法

2..1　卵母细胞的采集

从屠宰场摘取卵巢后放入30℃、加双抗的生理盐水。3h内带回实验室。用吸有约2　ml。抽卵液的10　mL注射器吸卵巢表面2～8　mm的卵泡液。在实体显微镜下检出A、B级卵丘一卵母细胞复合体(COCs)。

2..2　卵母细胞的体外成熟

卵母细胞体外成熟培养方式为微滴培养法，滴上覆盖石蜡油。在直径为35　mm的细胞培养皿滴6～8滴(100　μL/滴)，在培养箱预平衡2h。在38.5℃、5%　COz、饱和湿度培养箱进行24　h的成熟培养。分别记录培养的卵母细胞数。

2..3体外受精

将鲜精注入含3　mL洗精液的离心管底部，45。倾斜置于38.5℃、5%　C02、饱和湿度的培养箱内上浮30　min，然后吸取上层2　mL含有精子的洗精液转移至另一灭菌离心管中，加入5　mL洗精液，1200　r／min离心5　min，弃上清，用受精液稀释至1×l06lmL精子密度用于体外受精。

受精前2h做好受精液小滴，每滴50　t/L，上盖石蜡油，放人C02培养箱中平衡。在精子处理的同时，用200　ruL移液器反复吹打培养成熟的COCs。使卵子间相互分离。洗涤3次后，将15～20个COCs或（裸卵、半裸卵）移人各受精液滴中。然后将培养皿放人38.5℃、5%C02、饱和湿度培养箱中进行体外受精。

2..4　卵丘细胞的制备

取收集的COCs用透明质酸酶脱去周围的卵丘细胞，移去机械裸卵(　Dos)后将剩下的液体离心并用受精液洗3次，最终密度调至为l06～2×l06个／mL。

卵丘细胞共培养微滴的制备：将现制的卵丘细胞以50　μL加入平衡过的50μL微滴中继续平衡5　min，终密度为0.5×l06～1×l06／mL。每滴15～20枚卵母细胞。在5%COz，95%空气、饱和湿度、38.5℃条件下培养23～24　h后用胰蛋白酶去除周围的卵丘细胞，统计各组的受精情况。

2..5早期胚胎的体外培养

将假定的受精卵移入胚胎培养液SOF中洗涤3遍，用吸管轻轻反复抽吸，以除掉卵丘细胞和黏附在受精卵上的精子。然后在胚胎培养液SOF中洗涤2次后，移入预先在培养箱内平衡2h培养滴内。将20～25枚受精卵分别移入100　μL的胚胎培养液SOF(2%的必需氨基酸、1%的非必需氨基酸、2　mmol／L的谷氨酰胺、3　mg/mL牛血清白蛋白、10　ng/mL表皮生长因子）中，在38.5℃、5%　CO。、饱和湿度的培养箱中体外培养7～9天。第48　h统计卵裂率，每隔48　h半量更换培养液。第7～9天统计囊胚率。

2..6统计分析

采用SPSS统计软件@Independent　-　samples　t检验和One-　way　ANOVA进行方差分析。

3、结果与分析

3.1　添加的卵丘细胞对体外成熟卵母细胞的卵裂率及囊胚率的影响

表1显示：与对照组相比，添加的卵丘细胞能够显著提高脱除、部分脱除卵丘细胞组体外成熟卵母细胞的卵裂率及囊胚率(P<o．05)；与部分脱除组相比，在一定程度上对不脱除组的卵裂率及囊胚率有所促进，但差异不显著(P>0.05)：部分脱除组卵裂率及囊胚发育率要好于不脱除组，但差异不显著(P>0.05)，却显著优于对照组。

3.2　抗氧化剂对卵母细胞卵裂率及囊胚率的影响

试验结果显示：与对照组相比，受精液中填加褪黑素能够显著促进全部脱除、部分脱除及不脱除卵丘细胞的成熟卵母细胞的卵裂率及囊胚率(P<0.05)；部分脱除组、不脱除组卵母细胞的卵裂率及囊胚率显著好于全部脱除组及对照组(P<0.05)；表明褪黑素对卵母细胞受精及体外发育有重要的影响。

3.3　卵丘细胞与褪黑素联合对卵母细胞体外受精后卵裂率及囊胚发育的影响

试验结果表明卵丘细胞与褪黑素联合使用时，卵母细胞体外受精率后卵裂率及囊胚率显著好于对照组(P<0.05)：两者联合使用效果好于单独使用，但差异不显著(P>0.05)；部分脱除组显著优于脱除组(P<0.05)，在一定程度上好于不脱除组，但差异不显著(P>0.05)。

4、讨论

4.1　卵丘细胞对卵母细胞体外受精的作用是卵丘细胞的分泌物质

卵丘细胞对卵母细胞中谷光苷肽(GSH)的合成起着重要作用，因而无卵丘细胞的卵母细胞中GSH含量非常低。GSH对精子解聚和雄原核的形成起着重要作用‘，-3]。本试验研究卵丘细胞对脱除、部分脱除卵丘细胞的成熟卵母细胞的影响，对其体外受精的卵裂率及囊胚发育率进行了比较。结果显示，全部脱除组的卵裂率、囊胚发育率显著低于部分脱除组及不脱除组，并且达到了显著水平。但试验结果表明，全部脱除组是能够发育到囊胚的。研究表明，卵丘细胞在卵母细胞体外受精过程中有着许多重要作用，其中包括吸引、阻绊和选择精子，活力弱的精子在其阻绊下一般很难接近卵母细胞，所以部分脱除卵丘细胞组效果好于不脱除组。本试验结果中卵丘细胞脱除组的卵裂率也显著低于卵丘细胞部分脱除组(P<0.05)。在肉羊体外受精过程中精子活力下降要显著快于牛精液，因而卵母细胞周围的卵丘细胞可能会阻挡活力不断下降的精子对卵母细胞的受精，卵丘细胞部分脱除则可有效解决上述问题，这也是解释本实验结果与牛实验结果不同的一个原因。

4.2　卵丘细胞与褪黑素联合使用对体外受精后发育的影响

体外受精过程中，不断累积的活性氧会对精子、卵母细胞受精后胚胎造成毒性，不利于体外受精胚胎的发育。最近的一些研究表明，在洗精液、受精液、胚胎体外培养液中添加抗氧化剂，会有助于减缓活性氧的毒性作用，进而提高体外受精胚胎的卵裂率及囊胚率。褪黑素是由哺乳动物的松果体产生的一种胺类激素，能够有效清除细胞中自由基、阻止细胞凋亡、使其免受氧应激的影响。羊胚胎体外培养时，胚胎细胞进行有氧代谢会产生活性氧(　reactive　xygen　spe-cies，ROS)。生物细胞中ROS的含量及其与抗氧化剂之间的平衡对细胞正常生长和代谢至关重要。研究表明，高浓度的ROS影响激酶及其转录活性，从而影响细胞活性，使胚胎发育延缓，也可引起囊胚阶段羊胚胎细胞凋亡，并能对DNA，RNA造成损伤。而ROS低于正常生理值水平时．则会阻断氧化剂在机体增殖、防御等过程中的作用。

5、结论

本试验通过在体外受精液中添加卵丘细胞，能够显著促进体外成熟的裸卵及半裸卵的卵裂率及囊胚率，而对COCs的效果不显著；体外受精液中填加抗氧化剂褪黑素可以起到提高成熟卵母细胞卵裂率及囊胚率，卵丘细胞与褪黑素两者联合使用具有更加显著的效果。卵母细胞周围卵丘细胞部分脱除有助于提高卵裂率及囊胚率，卵丘细胞部分脱除组效果最佳。